Isolasi Pencernaan Sel Dendritik Limpa Mencit PriCells-Kolagenase untuk Pembuatan Suspensi Sel Limpa
Program tambahan:
Persiapan suspensi sel limpa dengan pencernaan kolagenase
Bahan Percobaan:
1. 4000U/ml kolagenase D, dicairkan dan diletakkan di atas es
2. HBSS, disterilkan, mengandung Ca + , Mg 2+ (dibeli di Life Technologies)
3. Limpa tikus
4. Jarum suntik, diameter 22G × 1 1/2 (Becton Dickinson)
5. Jarum suntik sekali pakai 10ml, 5ml (seperti Becton Dickinson)
6. Cawan petri diameter 100 mm (misalnya Falcon)
7. Anatomi gigi gergaji 2 autoklaf (misal Roboz)
8. Jaring baja tahan karat yang diautoklaf: Potong jaring baja tahan karat 40 jaring menjadi kotak kecil berukuran 5cm × 5cm, lipat tepinya ke bawah, lalu tekuk keempat sisinya ke dalam mangkuk persegi panjang yang dangkal; foil dibungkus dan diautoklaf.
metode eksperimental:
1. Encerkan 2 tabung berisi 1 ml 4000 U/ml kolagenase D (cukup untuk 20 limpa): 1 ml HBSS 9 ml (diencerkan hingga 4000 U/ml, langkah 8), 1 ml HBSS 39 ml (diencerkan hingga 100 U/ml). Tempatkan di atas es.
2. Pasang jarum 22G ke spuit 10 ml yang berisi 100 U/ml kolagenase. 10 ml larutan 100 U/ml ditambahkan ke dalam cawan Petri 100 mm.
3. Ambil cawan petri berdiameter 100mm lagi untuk pengoperasian. Pegang tang di satu tangan, alat suntik di tangan yang lain, dan ibu jari di piston. Limpa tikus dijepit dengan tang, dan ujung sempit kapsul limpa ditusuk dengan jarum, dan disuntikkan 100 ml 100 U/ml kolagenase. Gunakan tang untuk mendorong limpa ke arah jarum dan memajukan jarum beberapa milimeter. Kolagenase disuntikkan berulang kali dan dilanjutkan hingga 1 ml kolagenase disuntikkan ke dalam limpa, dan jarum menembus limpa dari ujung yang lain.
4. Gunakan jarum untuk merobek limpa dan pindahkan ke cawan Petri yang berisi kolagenase (Langkah 2). Ulangi sampai seluruh limpa tersuntik dan robek.
5. Kumpulkan suspensi sel dari cawan kedua dan tambahkan ke dalam tabung centrifuge 50 ml yang diletakkan di atas es. Cawan dibilas dengan 3 ml 100 U/ml kolagenase dan ditambahkan ke tabung centrifuge 50 ml di atas.
6. Tambahkan 3 ml 100 U/ml kolagenase ke dalam cawan petri. Limpa yang telah diparut dipindahkan ke cawan Petri secara bergantian. Mereka dirobek dengan 2 pinset menjadi potongan-potongan kecil berukuran 1 mm pada bagian sampingnya sehingga dapat melewati diameter dalam pipet 5 ml. Setelah seluruh limpa diparut, ditambahkan larutan kolagenase pada cawan petri yang sebelumnya diletakkan di atas potongan limpa dan ditiup beberapa kali dengan pipet 5 ml.
7. Miringkan cawan Petri, singkirkan serpihan besar, dan pindahkan suspensi sel ke dalam tabung sentrifugasi 50 ml yang diletakkan di atas es pada langkah 5. Cawan tersebut dicuci dengan beberapa mililiter 100 U/ml kolagenase dan ditambahkan ke dalam tabung sentrifugasi.
8. Tambahkan 10 ml 400 U/ml kolagenase ke dalam potongan limpa yang tersisa di cawan. Setelah dipipet beberapa kali, masukkan ke dalam inkubator selama 30-90 menit.
9. Pada tahap akhir inkubasi, hancurkan potongan-potongan tersebut dan isap ke dalam jaring baja steril dalam cawan Petri berdiameter 100 mm.
10. Kencangkan salah satu ujung stensil dengan pinset, cuci potongan dengan beberapa mililiter 100 U/ml kolagenase, lalu giling potongan dengan alat suntik steril 5 ml. Hancurkan sampai semua bahan merah hilang dari tisu. Jaring baja dicuci dengan beberapa mililiter 100 U/ml kolagenase.
11. Keluarkan stensil dari cawan Petri dan buang butiran yang tidak berwarna. Cairan dalam cawan Petri dihembuskan dengan keras dan dipindahkan ke tabung sentrifugasi 50 ml pada langkah 7. Cawan tersebut dicuci dengan beberapa mililiter 100 U/ml kolagenase dan ditambahkan ke tabung sentrifugasi (sekitar 0,5% sel dendritik atau kurang).
12. Bila perlu, sentrifugasi dengan BSA densitas tinggi.
lampiran:
Sel darah merah domba (EA) terkonjugasi antibodi:
2,5 ml eritrosit domba yang dikumpulkan (diekstraksi dalam larutan Alsever; Cocalico) dicuci 3 kali dengan PBS, dan disentrifugasi pada 350 g selama 5 menit setelah setiap pencucian. Kemudian diencerkan menjadi suspensi sel 5% ( 109 sel/ml) dengan PBS segar. Serum anti-eritrosit kelinci yang sangat peka diencerkan 1:50 dalam suspensi sel 5% (kemungkinan membentuk dosis antibodi subaglutinasi). Inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar dan sesekali balikkan larutan secara perlahan. EA yang terbentuk dicuci sebanyak 3 kali dengan RPMI 1640 (Life Technologies), kemudian EA diencerkan hingga suspensi sel 5% dengan PBS. Simpan pada suhu 4°C selama 2 minggu dan cuci sekali dengan RPMI sebelum digunakan.
Media lengkap RPMI-5:
Media RPMI1640 (Life Technologies), berisi:
5% FBS, panas dinonaktifkan pada 56°C selama 1 jam
HEPES 10mmol/L
20mg/ml gentamisin sulfat (Teknologi Kehidupan)
50mmol/ml 2-ME
Sterilisasi filtrasi
Solusi BSA kepadatan tinggi:
Dalam labu ukur 1 L, tambahkan 186 ml PBS, 29 ml 1 mol/L NaOH, 65 ml air (hati-hati, perhatikan cairannya dan jangan terciprat ke dalam botol). Jangan diaduk, oleskan 106g BSA (fraksi Cohn V, disarankan BSA penuh) pada permukaan larutan, tutup dengan kertas timah, dan dinginkan semalaman untuk melarutkan BSA secara perlahan.
Keesokan harinya, guncangan lembut telah berubah menjadi larutan bening agak coklat; indeks bias diukur sampai tempat desimal keempat terdekat. Kepadatan BSA yang benar (1,080 g/ml) memiliki indeks bias 1,384 hingga 1,385 pada 25 °C. Setelah indeks bias dikoreksi, pH diukur dengan kertas uji. PH harus antara 7,0 dan 7,4 dan umumnya tidak diperlukan penyesuaian.
Larutan filtrasi steril. Filter 47 mm (tipe Millpore) ditempatkan di atas unit filter 500 ml (Nalgene #156-4045) dan filter dibasahi dengan sedikit BSA. Filter vakum selama beberapa menit hingga BSA tersaring. Lepaskan pompa vakum dan dengan hati-hati tambahkan sisa larutan BSA ke reservoir di bagian atas filter (hindari berbusa. Gunakan pompa vakum dan filter untuk menyaring sisa BSA, ≥ 10 menit). Dapat disimpan selama 3 bulan pada suhu 4 °C.
Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical Co., Ltd.
