Metode pencernaan kolagenase - membiakkan sel induk mesenkim tali pusat

Sel induk mesenkim tali pusat manusia memiliki potensi diferensiasi yang tinggi, gen yang stabil, tidak rentan terhadap mutasi, dan tidak menyebabkan tumor; mereka tidak memerlukan pencocokan atau penolakan, dan banyak digunakan dalam pengobatan penyakit dan penelitian anti-penuaan. Saat ini, penerapannya di industri kecantikan dan kelompok sub-kesehatan juga semakin menarik perhatian.

Tali pusat sel induk mesenkim tali pusat terdiri dari kapsul, gusi Huatong, vena umbilikalis dan umbilikus arteri umbilikalis. Sel induk mesenkim tali pusat terdapat di gusi Huatong.
Karena jumlahnya yang sedikit, jumlah sel yang diperoleh setelah pencernaan dengan kolagenase pun sedikit. Selain itu, ketika kolagen diperoleh dengan metode pencernaan kolagenase umum, kolagenase lebih berbahaya bagi sel, dan sel yang dikultur berada dalam kondisi yang buruk.

Metode tempel adalah metode yang umum digunakan untuk mengkultur sel mesenkim tali pusat manusia, namun sel tersebut keluar dari jaringan dalam waktu yang lama (10-20 hari atau bahkan lebih lama). Setelah eksplorasi terus menerus, kami menemukan cara untuk mendapatkan sel induk mesenkim tali pusat melalui pencernaan kolagenase.

Metode operasi spesifiknya adalah sebagai berikut:
1 Setelah tali pusat bayi dan tali pusat ibu dipotong, segera klem dengan penjepit tali pusat untuk mencegah kontaminasi internal. Masukkan ke dalam kantong (wadah) steril dan pindahkan ke laboratorium.
2 Di dalam lemari keamanan hayati atau di bangku yang bersih, lepaskan tali pusar dan gunakan rendaman alkohol 75% selama 2 menit (tabung sentrifugasi 50ml atau piring 250px). Jika tali pusat panjang dan tidak dapat dimasukkan ke dalam wadah, tali pusat dapat dipotong sekitar 250 piksel, namun penjepit tali pusat harus ditambahkan sebelum dipotong untuk mencegah alkohol masuk ke tali pusat dan merusak sel.
3 Setelah diolah dengan alkohol, segera pindahkan ke wadah berisi PBS atau garam sebanyak 2 kali, setiap kali 2 menit.
4 Potong klip tali pusat, potong tali pusat menjadi segmen 2-75px, gunakan gunting untuk memotong tali pusat dari bagian dalam vena umbilikalis, dan gunakan kalajengking kalajengking (jaringan tali pusat relatif licin, dengan kalajengking kalajengking untuk dioperasi) ke vena umbilikalis, arteri umbilikalis, dan tali pusar. Amplop dilepas untuk mencegah penggabungan sel lain-lain.
5 Potong jaringan tali pusat dengan gunting, encerkan 0,1% kolagenase tipe II (larutan pengenceran dengan DMEM/F12) semalaman, dan cerna semalaman pada suhu 4 °C.
6 Keesokan harinya, tuangkan jaringan yang belum tercerna ke dalam saringan baja 100 mesh (80 mesh, 160 mesh) (sebaiknya saringan jaring baja, membawa jaringan dalam jumlah besar agar mudah dioperasikan), dengan PBS (atau saline) bilas beberapa kali untuk menghilangkan sebanyak mungkin kolagenase dari permukaan jaringan. Terakhir, bilas dengan 1-2 kali media lengkap untuk menghilangkan PBS (atau saline).
7 Tuang ke dalam piring (tidak nyaman untuk dimasukkan ke dalam botol), tambahkan sedikit kultur sedang pada blok jaringan yang belum tercerna (6ml plus 2-3ml, 10ml plus 3-4ml) (tujuannya adalah untuk mengurangi sisa kolagenase pada sel-sel yang terluka). Keesokan harinya, blok jaringan hilang sama sekali (kolagenase yang terbenam di dalam jaringan dicerna), sel-sel tersebar seluruhnya, dan di bawah mikroskop, terdapat banyak sel yang tersebar di jaringan yang sudah dicerna. Sejumlah kecil media (150 px ditambah 2-3 ml, 250 px ditambah 4-5 ml) ditambahkan ke dalam media dan kultur dilanjutkan.
8 Setelah dua hari, lanjutkan menambahkan sedikit medium (150px plus 2-3ml, 250px plus 4-5ml).
9 Setelah satu atau dua hari, jumlah sel akan meningkat secara signifikan (banyak pertumbuhan koloni), dipindahkan ke dalam dua tabung centrifuge 50ml, tambahkan PBS (atau saline) ke dalam 50ml, campur, centrifuge pada 2500rpm, 6 menit.
10 Suspensikan kembali dalam 5-6 ml (tergantung jumlah sel) dalam medium lengkap, sentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 6 menit, masukkan ke dalam labu T25, dan tambahkan 5 ml medium lengkap.
Setelah 13 hari, kultur dapat dilanjutkan dengan mengganti media atau menambahkan 3-4 ml media lengkap. Setiap tiga hari sekali, ganti cairan sampai habis (lebih dari 70% dapat diturunkan)

Catatan Wahyu:
1 Cara ini mudah dioperasikan dan mempunyai waktu inkubasi yang singkat.
2 Pencernaan tali pusat dengan kolagenase, pada suhu 37°C, tali pusat pada dasarnya dapat dicerna dalam beberapa jam, tetapi pada saat yang sama kerusakan selnya lebih besar. Kolagenase dapat menembus ke dalam jaringan tali pusat, dan konsentrasi kolagenase yang rendah mencerna jaringan dari dalam ke luar, sehingga menyebabkan lebih sedikit kerusakan sel. (Tripsin memiliki efek pencernaan yang sangat buruk pada jaringan tali pusat)
3 Alasan untuk mencerna jaringan secara menyeluruh dan tidak memisahkan sel secara terpisah adalah karena komponen kolagen umbilikal (kental) mendorong proliferasi sel induk mesenkim tali pusat. Sebagian besar sel tersuspensi dalam kolagen dan berkembang biak dalam koloni, yang merupakan alasan utama mengapa sel tetap dalam kondisi baik.
4 Saat membiakkan sel induk mesenkim tali pusat, jangan gunakan media yang mengandung serum (serum mendorong diferensiasi sel), tetapi gunakan media khusus sel induk. Bagian ini juga diusahakan untuk tidak mencerna trypsin (kerusakan trypsin pada sel induk mesenkim tali pusat), cairan pencernaan khusus harus digunakan untuk memastikan waktu perjalanan yang lebih lama.