Instruksi Manual untuk Kit ELISA Tikus Kolagenase I

Instruksi Manual untuk Kit ELISA Tikus Kolagenase I

Kit ini hanya untuk penggunaan penelitian in vitro, bukan untuk diagnosis klinis!

Aplikasi yang dimaksudkan

Metode ELISA digunakan untuk menentukan secara kuantitatif kandungan Kolagenase I dalam serum tikus, plasma atau cairan biologis terkait lainnya.

Prinsip eksperimental

Lapisi pelat microwell dengan antibodi kolagenase I yang telah dimurnikan untuk membuat pembawa fase padat. Tambahkan spesimen atau standar, antibodi kolagenase I yang terbiotinilasi dan avidin berlabel HRP ke dalam lubang mikro secara bergantian, setelah pencucian menyeluruh Pengembangan warna dengan substrat (TMB). TMB diubah menjadi biru di bawah katalisis peroksidase, dan menjadi kuning akhir di bawah aksi asam. Kedalaman warna berkorelasi positif dengan kolagenase I dalam sampel. Ukur penyerapan (nilai) pada 450nm dengan pembaca pelat mikro untuk menghitung konsentrasi sampel.

Komposisi kit dan persiapan reagen

1. Microplate: satu bagian (96 sumur)

2. Produk standar (produk lyophilized): 2 botol, harap siapkan dalam waktu 15 menit sebelum digunakan. Setiap botol diencerkan hingga 1 ml dengan pengencer sampel. Setelah ditutup, didiamkan pada suhu kamar selama kurang lebih 10 menit. Sekaligus dibalik/digosok berulang kali untuk membantu larut. Konsentrasinya 100 ng/ml. Lakukan pengenceran ganda dalam cawan), lalu siapkan 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,12 ng/ml, 1,56 ng/ml, dan pengenceran sampel langsung 0 ng/ml sebagai sumur kosong. Misalnya, untuk menyiapkan standar 50 ng/ml: ambil 0,5ml (tidak kurang dari 0,5ml) dari standar di atas 100ng/ml dan tambahkan ke dalam tabung Eppendorf yang berisi 0,5ml pengencer sampel, aduk rata, dan sisa konsentrasi dapat disimpulkan dengan analogi.

3. Contoh pengencer: 1 × 20ml.

4. Uji pengenceran A : 1×10ml.

5. Uji pengencer B: 1×10ml.

6. Solusi deteksi A: 1×120 per botol (1:100). Sebelum digunakan, encerkan dengan Pengencer Uji A 1:100 (misal: 10 Larutan Uji A / 990 Pengencer Uji A), aduk rata, dan siapkan sesuai dengan jumlah total yang telah dihitung sebelumnya yang diperlukan untuk setiap percobaan (100 / Lubang), lebih banyak 0,1-0,2ml harus disiapkan selama persiapan sebenarnya.

7. Solusi deteksi B: 1×120 per botol (1:100). Encerkan 1:100 dengan pengenceran uji B segera sebelum digunakan. Metode pengencerannya sama dengan metode Larutan Uji A.

8. Larutan substrat : 1×10ml/botol.

9. Cairan pencuci pekat: 1×30ml/botol, tiap botol diencerkan 25 kali dengan air suling.

10. Larutan penghenti : 1×10ml/botol (2 mol/L H2SO4).

11. Laminasi : 5 lembar

12. Instruksi manual: 1 salinan

Bawalah barang-barang Anda sendiri

1. Pembaca pelat mikro (disarankan untuk memanaskan instrumen terlebih dahulu sebelum digunakan)

2. Perangkat dosis mikro dan ujung pipet, tabung EP

3. Air suling atau deionisasi, kertas saring

Pengumpulan dan pelestarian spesimen

1. Serum: Sampel darah utuh harus dibiarkan pada suhu kamar selama 2 jam atau 4 malam. Setelah sentrifugasi pada 1000 g selama 20 menit, ambil supernatan untuk dideteksi, atau simpan supernatan pada -20 atau -80, tetapi hindari pembekuan dan pencairan berulang kali. .

2. Plasma: EDTA atau heparin dapat digunakan sebagai antikoagulan. Sentrifugasi sampel pada 1000 g selama 15 menit dalam waktu 30 menit setelah pengumpulan. Supernatan dapat diambil untuk dideteksi, atau supernatan harus disimpan pada suhu -20 atau -80, tetapi diulangi Bekukan dan cairkan.

3. Spesimen biologis lainnya: sentrifugasi pada 1000 g selama 20 menit, ambil supernatan untuk pengujian, atau simpan supernatan pada -20 atau -80, tetapi hindari pembekuan dan pencairan berulang kali.

Catatan: Spesimen di atas harus disegel dan disimpan, 4 harus disimpan kurang dari 1 minggu, -20 tidak boleh lebih dari 1 bulan, -80 tidak boleh lebih dari 2 bulan; Spesimen hemolisis akan mempengaruhi hasil pemeriksaan akhir, sehingga spesimen hemolisis sebaiknya tidak dilakukan pengujian.

Tangga

Sebelum memulai percobaan, semua reagen harus diseimbangkan pada suhu kamar, dan reagen tidak boleh dilarutkan secara langsung pada suhu 37; saat menyiapkan reagen atau sampel, keduanya harus tercampur rata, dan usahakan tidak berbusa saat pencampuran. Konten sampel harus diprediksi sebelum percobaan. Jika konsentrasi sampel terlalu tinggi, sampel harus diencerkan agar sampel yang diencerkan memenuhi rentang deteksi kit, dan kemudian dikalikan dengan faktor pengenceran yang sesuai saat menghitung.

1. Tambahkan sampel: atur lubang kosong, lubang standar, dan lubang sampel yang akan diuji masing-masing. Tambahkan 100% pengencer sampel ke dalam sumur kosong, dan 100% standar atau sampel yang akan diuji ke dalam sumur yang tersisa. Hati-hati jangan sampai ada gelembung udara. Tambahkan sampel ke bagian bawah pelat enzim saat menambahkan sampel. Usahakan untuk tidak menyentuh dinding sumur. Tutup atau tutupi pelat target dan inkubasi pada suhu 37 selama 2 jam. Untuk memastikan bahwa hasil percobaan valid

Untuk setiap percobaan, harap gunakan larutan standar baru.

2. Buang cairannya dan keringkan tanpa dicuci. Tambahkan 100 larutan kerja larutan deteksi A (disiapkan sebelum digunakan) ke setiap sumur, tambahkan pelat mikro ke membran, dan inkubasi pada suhu 37 selama 1 jam.

3. Buang cairan yang ada di lubang, keringkan, cuci piring 3 kali, rendam selama 1-2 menit setiap kali, sekitar 400 per lubang, keringkan (Anda juga bisa menepuk-nepuk cairan di lubang hingga kering).

4. Tambahkan 100% larutan kerja larutan uji B (disiapkan sebelum digunakan) ke setiap sumur, tambahkan pelapis, dan inkubasi pada suhu 37 selama 1 jam.

5. Buang cairan pada lubangnya, keringkan, cuci piring sebanyak 5 kali, caranya sama seperti langkah ke 3.

6. Tambahkan larutan substrat 90 per sumur, pelat label enzim dan film 37 untuk menghindari pengembangan warna (waktu reaksi dikontrol pada 15-30 menit, ketika 3-4 sumur pertama dari sumur standar memiliki gradien biru yang jelas, 3 yang terakhir -Jika gradien dari 4 sumur tidak jelas, maka dapat dihentikan).

7. Tambahkan 50% stop solution ke setiap sumur untuk menghentikan reaksi. Saat ini warna biru berubah menjadi kuning. Urutan penambahan larutan penghenti harus sama dengan urutan larutan substrat.

8. Segera ukur kerapatan (nilai) optik setiap sumur dengan microplate reader pada panjang gelombang 450nm.

Catatan:

1. Persiapan reagen: Semua reagen harus diseimbangkan pada suhu kamar sebelum digunakan. Harap simpan reagen sesuai petunjuk segera setelah digunakan. Harap gunakan tip sekali pakai selama percobaan untuk menghindari kontaminasi silang.

2. Penambahan sampel: pada saat menambahkan sampel atau menambahkan reagen, jika selang waktu antara sumur pertama dan sumur terakhir terlalu lama, maka akan mengakibatkan waktu “pra-inkubasi” yang berbeda, yang tentunya akan mempengaruhi nilai terukur Akurasi dan pengulangan. Waktu penambahan satu sampel (termasuk standar dan semua sampel) paling baik dikontrol dalam waktu 10 menit. Disarankan untuk menyiapkan beberapa lubang untuk eksperimen.

3. Inkubasi: Untuk mencegah sampel menguap, letakkan pelat berlabel enzim dengan penutup atau membran di dalam kotak basah selama percobaan untuk menghindari penguapan cairan; langkah selanjutnya harus dilakukan sesegera mungkin setelah mencuci piring, dan harus dihindari setiap saat Pelat mikro dalam keadaan kering; pada saat yang sama, waktu dan suhu inkubasi yang diberikan harus diperhatikan dengan ketat.

4. Pencucian: Cairan pencuci yang tersisa dalam sumur reaksi selama proses pencucian harus ditepuk-tepuk hingga kering pada kertas saring. Jangan memasukkan kertas saring langsung ke dalam sumur reaksi untuk menyerap air. Pada saat yang sama, sisa cairan dan sidik jari di bagian bawah pelat harus dihilangkan untuk menghindari mempengaruhi pembacaan instrumen label enzim akhir.

5. Persiapan reagen: sebelum digunakan, kocok tangan beberapa kali atau sentrifugasi beberapa saat untuk mencegah cairan pada dinding tabung atau tutup botol mengendap di dasar tabung. Produk standar, larutan kerja A, dan larutan kerja B harus disiapkan sesuai dengan jumlah yang diperlukan, dan disiapkan dengan pengencer yang sesuai, agar tidak tertukar. Harap persiapkan larutan standar dan larutan kerja secara akurat, dan usahakan untuk tidak menyiapkan dalam jumlah kecil (seperti saat mengambil larutan uji A, tidak boleh kurang dari 10 sekaligus) untuk menghindari kesalahan konsentrasi karena pengenceran yang tidak akurat; jangan menggunakan kembali standar yang telah diencerkan dan uji cairan kerja Larutan A, larutan deteksi cairan kerja B.

6. Kontrol waktu reaksi: Harap amati perubahan warna reaksi dengan baik secara teratur setelah menambahkan media (misalnya, setiap 10 menit). Jika warnanya gelap, harap tambahkan larutan penghenti terlebih dahulu untuk menghentikan reaksi agar reaksi tidak terlalu kuat dan mempengaruhi pembaca pelat mikro. Pembacaan kepadatan optik.

7. Substrat: Harap jauhkan media dari cahaya, dan hindari paparan langsung terhadap cahaya terang selama penyimpanan dan inkubasi.

Metode pencucian

1. Metode pencucian pelat manual: Suntikkan setidaknya 0,4 ml buffer pencuci yang disarankan ke dalam sumur, rendam selama 1-2 menit, aspirasi (jangan menyentuh dinding pelat) atau kibaskan cairan dalam pelat enzim, dan letakkan beberapa lapis di atas meja percobaan Kertas penyerap, dengan pelat mikrotiter menghadap ke bawah dan tepuk-tepuk dengan kuat beberapa kali; ulangi proses ini beberapa kali sesuai kebutuhan.

2. Pencucian piring otomatis: Jika ada mesin cuci piring otomatis, sebaiknya digunakan dalam proses percobaan formal setelah digunakan dengan baik.

Kekhususan

Kit ini dapat mendeteksi kolagenase I tikus rekombinan atau alami pada saat yang sama, dan tidak memiliki reaktivitas silang dengan protein terkait lainnya.

Perhitungan

Setiap nilai standar dan sampel dikurangkan dari nilai lubang kosong (diagram 7 titik). Jika beberapa lubang dibuat, nilai rata-rata harus digunakan untuk perhitungan. Dengan mengambil konsentrasi produk standar sebagai ordinat (koordinat logaritmik) dan nilai sebagai absis (koordinat logaritma), gambarlah kurva standar pada kertas koordinat logaritmik. Disarankan untuk menggunakan perangkat lunak pembuat kurva profesional untuk analisis, seperti ahli kurva 1.3, sesuai dengan nilai sampel, temukan konsentrasi yang sesuai dari kurva standar, dan kalikan dengan faktor pengenceran; atau gunakan konsentrasi dan nilai standar untuk menghitung persamaan regresi kurva standar, lalu nilai sampel disubstitusikan ke dalam persamaan, konsentrasi sampel dihitung, lalu dikalikan dengan faktor pengenceran, yaitu konsentrasi sampel sebenarnya.

Rentang deteksi: 1,56 ng/ml-100 ng/ml, harap gambarkan nilai konsentrasi berikut untuk menggambar kurva standar: 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,12 ng/ml, 1,56 ng/ml.

Batas deteksi minimum: 0,78 ng/mL

Penjelasan

1. Karena kondisi yang ada dan tingkat ilmu pengetahuan dan teknologi, tidak mungkin dilakukan identifikasi dan analisis menyeluruh terhadap seluruh bahan baku yang disediakan oleh seluruh pemasok,

Produk ini mungkin memiliki risiko kualitas dan teknis tertentu.

2. Hasil akhir eksperimen berkaitan erat dengan efektivitas reagen, operasi yang relevan dari eksperimen, dan lingkungan eksperimen pada saat itu, harap pastikan

Siapkan spesimen secukupnya untuk cadangan.

3. Hindari memaparkan reagen terhadap cahaya yang kuat selama penyimpanan dan inkubasi. Semua tutup botol reagen harus tertutup rapat untuk mencegah penguapan dan kontaminasi mikroba, karena gangguan enzim proteolitik akan menyebabkan hasil yang salah.

4. Penyimpanan kit: Harap simpan standar, larutan deteksi A dan larutan deteksi B pada -20 sesegera mungkin setelah menerima kit, dan simpan sisa reagen pada suhu 4 untuk penyimpanan jangka pendek dan -20 untuk penyimpanan jangka panjang. Setelah dibuka, pelat mikro harus ditutup dengan pengering dan disimpan pada suhu -20 untuk menghindari kelembapan.

5. Garam akan mengendap dari cairan pencuci pekat, yang dapat dipanaskan dan dilarutkan dalam penangas air bila diencerkan.

6. Mungkin ada sedikit zat seperti air di dalam lubang pelat yang terhubung dengan enzim yang baru saja dibuka. Ini adalah fenomena normal dan tidak akan berdampak apa pun pada hasil eksperimen.

7. Validitas: 6 bulan.